Два типа фоторецепторов в ахроматической зрительной системе виноградной улитки

Ахроматическое зрение, по определению, не чувствительно к цветовой составляющей сигнала, а выделяет только его яркость, физическим аналогом которой является интенсив­ность светового излучения. Вопрос о нейронных механизмах восприятия интенсивности света остается дискуссионным.

Традиционно нервный код интенсивности света рассматривается как соответствие между величиной яркости стимула и такими характеристиками работы нейронов, как ча­стота импульсной активности, величина межимпульсных интервалов, распределение потен­циалов действия во времени и т. п. (см., например: Батуев, Куликов, 1983). Существенным в данном случае является не тип реакции, а то, что при любой ее разновидности для вос­приятия интенсивности света достаточно участия одной, не разлагаемой на самостоятель­ные компоненты нейрональной системы. Принципиально другой подход связывает вос­приятие интенсивности света с активностью не одной, а двух независимых нейрональных систем – «яркостной» и «темновой», отвечающих на изменение освещенности одновремен­но, но противоположным образом (Heggelund, 1974; Фомин, Соколов, Вайткявичус, 1979; Izmailov, Sokolov, 1991). Так, осветление стимула приводит к возбуждению яркостного и торможению темнового каналов, тогда как его потемнение вызывает обратный эффект. При подобном способе реагирования параметры ответов каждой отдельной системы утрачива­ют свое значение и интенсивность света однозначно связывается только с cоотношением одновременной активности яркостных и темновых базисных элементов. Если отразить характер работы этих элементов геометрически, то получится следующее. Cенсорный об­раз интенсивности света S_i будет представлен вектором _X1iX2i в двумерной ортогональной системе координат (X₁ – числовая ось активности яркостной системы, а X₂ – числовая ось активности темновой системы). Воспринимаемое изменение интенсивности излучения с S_i на S_j ведет к изменению координат и формированию нового вектора _X1jX2j. В соответствии с этим математическим представлением нервное преобразование, при котором определенно­му значению интенсивности излучения соответствует определенное соотношение активно­сти яркостной и темновой нейронных систем, получило название векторного кодирования интенсивности света (Соколов, 2003).

Принципиальная идентичность опорных механизмов восприятия интенсивности света у человека и животных во многом определяет значимость исследований клеточных механизмов ахроматического зрения на упрощенных объектах. Особенно привлекательна в этом отношении виноградная улитка: зрительная система данного моллюска естествен­ным образом упрощает световой сигнал, поскольку, в силу неспособности к цветоразли­чению, воспринимает только яркостную составляющую излучения. Причиной цветовой слепоты виноградной улитки является то, что все ее фоторецепторы содержат одинаковый фотопигмент. Об этом свидетельствует кривая спектральной чувствительности глаза вино­градной улитки, имеющая единственный пик в области 475 нм (Von Berg, Shneider, 1972; Черноризов и др., 1992) и близкая к кривой родопсина на номограмме Дартналла (Dartnall, 1953). Таким образом, являясь aхроматом по своей природе, виноградная улитка представ­ляет собой идеальную биологическую модель для изучения механизмов кодирования ин­тенсивности света.

Редукции зрительной функции соответствует упрощенная морфология сетчатки ви­ноградной улитки. Тщательное исследование ультраструктуры глаза Helix pomatia (вино­градной улитки) (Зайцева, 1992) и Helix asperca (ближайшего родственника Helix pomatia) (Eakin, Brandenburger, 1967) обнаружило три типа элементов: фоторецепторы, опорные и нервные клетки. Поскольку опорные клетки являются вспомогательными, а нейроны не­многочисленны (по данным Brandenburger – 12 штук в основании ретины), основную ин­формационную функцию выполняют фоторецепторы. Эти фоторецепторы типично рабдо­мерные и несут микровиллы, в которых содержатся светочувствительные гранулы. Помимо клеточного тела, фоторецепторы имеют длинные аксоны, обладающие спайк-генерирующим механизмом. Эти аксоны образуют оптический нерв и в его составе уходят в ЦНС. Таким образом, фоторецепторы виноградной улитки являются элементами, совмещающими соб­ственно рецепторную функцию и функцию первичного сенсорного нейрона.

Допущение о существовании в однослойной сетчатке виноградной улитки фоторе­цепторов, характеризующихся эндогенными противоположно направленными ответами на освещение, требует электрофизиологического обследования этих фоторецепторов в усло­виях полной их изоляции от синаптических влияний. Результаты такой проверки представ­лены в данной работе.

Методика

Глаза виноградной улитки расположены на вершинах задних головных щупалец. При типичном камерном строении они имеют роговицу, хрусталик, стекловидное тело и одно-слойную сетчатку. При подготовке препарата сначала выделялся глазной бокал, затем че­рез круговой надрез по его краям удалялся хрусталик и, наконец, ретина полностью осво­бождалась, отсекаясь от основания оптического нерва. В таком виде она инкубировалась в трипсине при температуре 37,5° в течение 17–20 мин. Процедура энзиматической обработ­ки сетчатки виноградной улитки позволяла получить большое количество полностью изо­лированных фоторецепторов, часть которых переносилась в экспериментальную камеру, содержащуюся при комнатной температуре и наполненную проточным физиологическим раствором для беспозвоночных. Пассивное пребывание фоторецепторов в протоке в тече­ние 15 мин обеспечивало их промывку. После этого на фоне темновой адаптации внутри­клеточно регистрировались электрические реакции отдельных фоторецепторов, возникаю­щие на освещение. Для стимуляции использовались вспышки белого цвета стандартной яркости – 25 кд/м² . Время действия светового сигнала варьировало от 10 мс до 10 с в раз­ных экспериментах.

Ионная избирательность светозависимых каналов изолированных фоторецепторов виноградной улитки контролировалась с помощью поочередной замены через проток фи­зиологических растворов, омывающих препарат. В этой процедуре наряду с нормальным физиологическим раствором использовались растворы, лишенные либо ионов натрия, либо кальция, либо обоих этих ионов и сбалансированные трис-ионами.

При обследовании полностью изолированных фоторецепторов виноградной улитки было обнаружено, что по знаку электрофизиологического ответа на освещение они могут быть разделены на два типа: реакция одних состояла в деполяризационном, а других – в гиперполяризационном сдвиге мембранного потенциала. Пример противоположного зна­ка реагирования на свет фоторецепто­ров разных типов представлен на рис. 1. Фоторецепторы, деполяризующиеся при освещении, характеризуются следую­щим: на фоне темновой адаптации их по­тенциал покоя колеблется в пределах от –27 мВ до –40 мВ в разных фоторецеп­торах. Световая вспышка вызывает ре­цепторный ответ в виде деполяризацион­ного смещения МП с начальным пиком и последующим замедленным спадом. Фоторецепторы, отнесенные ко второму типу, в отличие от клеток, деполяризую­щихся при освещении, отвечают на световой стимул продолжительной гиперполяризаци­онной волной, которой предшествует кратковременное и низкоамплитудное отклонение МП в сторону деполяризации. Потенциал покоя фоторецепторов, гиперполяризующихся при освещении, на фоне темновой адаптации составляет от –45 мВ до –56 мВ в разных фоторецепторах. Подобную реакцию продемонстрировали только 28 % клеток от общего числа обследованных элементов.

Световой фон или предшествующее действию тестового стимула освещение умень­шают, вплоть до полного подавления, ответы фоторецепторов обоих типов. Так, пред­варительное 10-минутное непрерывное освещение приводит к полному исчезновению фоторецепторного ответа как деполяризационного, так и гиперполяризационного типа. Восстановление световой чувствительности фоторецепторов обоих типов достигается в ходе темновой адаптации. Динамика этого процесса контролировалась при использова­нии тестовой вспышки, подаваемой в ходе темновой адаптации с 5-минутным интервалом. Интенсивность ответной реакции фоторецептора определялась по величине амплитуды на­чального пика деполяризации (для деполяризующихся рецепторов) или амплитуды волны гиперполяризации (для гиперполяризующихся рецепторов). Во время темновой адаптации чувствительность как деполяризующихся, так и гиперполяризующихся фоторецепторов постепенно возрастала, о чем свидетельствует увеличение амплитуды их реакции на стаци­онарную вспышку. Полное восстановление активности фоторецепторов достигалось после их 18–25-минутного пребывания в темноте.

Следующая серия экспериментов была посвящена определению ионной избира­тельности светозависимых каналов изолированных фоторецепторов виноградной улитки. Известно, что основными участниками светоуправляемой проводимости фоторецепторов как позвоночных, так и безпозвоночных животных являются, как правило, ионы Na⁺ и Ca²⁺ (Бызов, 1971). Поэтому в механизмах генерации как деполяризационного, так и гипер­поляризационного фоторецепторных потенциалов виноградной улитки выявлялась роль именно этих ионов. Для этого производилась регистрация электрической активности фото-рецепторов обоих типов при поочередном удалении из инкубационной среды Na⁺ или Ca²⁺ (с заменой на трис-ион), а также контролировалось последующее восстановление ответов в нормальном физиологическом растворе после каждой процедуры. Концентрация Na⁺ и Ca²⁺ быстро менялась путем замены физиологических растворов через проток.

На рис. 2 демонстрируется влияние ионов Na⁺ и Ca²⁺ на ответы фоторецепторов, де-поляризующихся при освещении. В данных клетках отсутствие Na⁺ во внеклеточной среде приводит к значительной редукции ответа, не вызывая, однако, его полного исчезновения. Пример этого эффекта представлен на рис. 2,А, где видно, что амплитуда рецепторного по­тенциала при исходном значении 14 мВ сократилась до 3,5 мВ, когда препарат содержался в безнатриевой среде. Дальнейшего падения ответа не зафиксировано, поскольку в таком усеченном виде реакция оставалась и через 12 мин после выведения Na⁺ из экзогенного рас­твора. Восстановление полноценного рецепторного потенциала клетки, деполяризующейся при освещении, достигалось «отмыванием» препарата при замене безнатриевого раствора на нормальный. Поскольку отсутствие натрия в инкубационной среде подавило рецепторный ответ не полностью, проверялось действие еще одного, наиболее вероятного участника гене­рации рецепторного потенциала – ионов Ca²⁺. Эффект при удалении внеклеточного Ca²⁺, де­монстрируемый на рис. 2,Б, также состоял в том, что амплитуда деполяризационного ответа уменьшилась, но полностью не исчезла. Изолированный фоторецептор, деполяризующийся при освещении, полностью терял эту способность только тогда, когда раствор вокруг него заменялся на среду, не содержащую одновременно ни ионов Na⁺, ни ионов Ca²⁺ (рис. 2,В).

Рис. 2. Влияние удаления внеклеточного натрия и кальция на ответ фоторецептора виноградной улитки, деполяризующегося при освещении:

А – Влияние концентрации внеклеточного Na+: а – фоновый ответ фоторецептора на освещение в нормальном растворе; б – ответ на тот же стимул после 12 минут содержания фоторецептора в безнатриевой среде; в – восстановление световой чувствительности фоторецептора после замены безнатриевого раствора на нормальный;

Б – Влияние концентрации внеклеточного Ca²⁺: г – фоновый ответ на освещение того же фото-рецептора в нормальном физиологическом растворе; д – ответ на освещение после 6-минутной инкубации клетки в бескальциевом растворе; е – восстановление исходного ответа после замены бескальциевого раствора на нормальный;

В – Влияние одновременного удаления внеклеточного Na+ и Ca²⁺: ж – фоновый ответ на освещение; з – ответ на освещение в среде, не содержащей ионов натрия и альция через 5 минут после замены раствора; и – восстановление утраченного ответа в нормальном физиологическом растворе. Калибровка 10 мВ, 10 с.

Рис. 3. Влияние удаления внеклеточного натрия и кальция на ответ фоторецептора виноградной  улитки, гиперполяризующегося при освещении.

А – Влияние концентрации внеклеточного Na+: а – фоновый ответ фоторецептора на освещение в нормальном растворе; б – ответ на тот же стимул после 3 минут содержания фоторецептора в безнатриевой среде; в – восстановление световой чувствительности фоторецептора после замены безнатриевого раствора на нормальный;

Б – Влияние концентрации внеклеточного Ca²⁺ : г – ответ на освещение того же фоторецептора в нормальном физиологическом растворе; д – ответ на освещение после 4-минутной инкубации клетки в бескальциевом растворе; е –восстановление исходного ответа после замены бескальциевого раствора на нормальный. Калибровка 10 мВ, 10 с.

Обсуждение

Одним из свойств, отличающих фоторецепторы позвоночных от фоторецепторов беспозвоночных животных, считается полярность их ответа на освещение. Если палочки и колбочки позвоночных животных реагируют на свет гиперполяризаций (см., например: Tomita et al., 1967; Toyoda et al., 1970), то у большинства беспозвоночных освещение вы­зывает не гипер-, а деполяризацию фоторецепторов. Последнее хорошо изучено на примере Limulus (Fuortes, 1959; Benolken, 1961).

Однако некоторые беспозвоночные демонстрируют исключительные случаи «двой­ной сетчатки», когда разные электрофизиологические эталоны, характерные для фото-рецепторов беспозвоночных и позвоночных животных, совмещены в одной рецепторной системе. Такой феномен впервые был обнаружен у морского гребешка (Pecten), одна часть фоторецепторов которого реагирует на освещение гиперполяризационным, а другая – де-поляризационным смещением фонового уровня мембранного потенциала. Это было выяв­лено сначала на интaктной ретине исследуемого моллюска (McReynolds and Gorman, 1970), а в дальнейшем подтверждено и на его изолированных фоторецепторах (Nasi and Gomez, 1992). Противоположным типам электрофизиологических реакций разных фоторецепторов Pecten соответствует разновидность их морфологии. Гиперполяризационный рецепторный ответ обнаруживают фоторецепторы цилиарного типа (характерного для позвоночных), а деполяризационный – классические у беспозвоночных рабдомерные светочувствительные клетки (Musio, 2001).

Сетчатка виноградной улитки (объекта настоящего исследования) включает лишь типично рабдомерные фоторецепторы. Их морфологическое разнообразие сводится к раз­меру микровилл, одни из которых достигают 100 мнм, а другие несут короткие (до 12 мнм) и нерегулярные микровиллы (Eakin и Brandenburger, 1967). Прямые данные об электро­физиологической неоднородности сетчатки виноградной улитки нами не обнаружены, хотя косвенно об этом свидетельствуют эксперименты H. Gillary (1970). Не вскрывая глазной бокал, H. Gillary впервые зарегистрировал суммарную электрическую активность сетчатки (ЭРГ) этого моллюска, которая меняла свою полярность при перемещении накладного ре­гистрирующего электрода по поверхности глаза. Поскольку сетчатка виноградной улитки однослойная фоторецепторная, данные H. Gillary находят объяснение при допущении, что электрофизиологически неоднородны именно фоторецепторы.

Основным результатом нашей работы является экспериментальное доказательство существования в сетчатке виноградной улитки двух разновидностей клеток, реагирующих на свет противоположно: одни гиперполяризуются, а другие деполяризуются при освеще­нии. Таким образом, сетчатка виноградной улитки Helix pomatia, как и сетчатка гребеш­ка Pecten, может быть отнесена к явлениям «двойной ретины», поскольку включает две группы фоторецепторов с противоположно направленными электрическими реакциями на освещение.

В связи с тем что этот результат получен при исследовании полностью изолиро­ванных клеток, гарантированно лишенных синаптических контактов, можно утверждать, что разнонаправленность фоторецепторных ответов (как де-, так и гипер-) у виноградной улитки обусловлена не «сетью» (т. е. межклеточным взаимодействием), а эндогенно, т. е. собственными качествами фоторецепторов. К таким качествам относится и ионная избира­тельность светочувствительных каналов фоторецепторной мембраны. Одинаковы ли ионы, движение которых создает противоположно направленные фоторецепторные потенциалы виноградной улитки?

В наших экспериментах контролировалось участие ионов натрия и кальция в фото­рецепторных ответах обеих противоположных полярностей. Как известно (Бызов, 1971), свет вызывает в фоторецепторах позвоночных животных гиперполяризацию, а в фоторе­цепторах большинства исследованных беспозвоночных (мечехвост, насекомые и головоно­гие) – деполяризацию. При этом ионные механизмы генерации рецепторных потенциалов в основном сходны: в обоих случаях свет порождает изменение проводимости натриевых каналов, только у позвоночных они на свету закрываются, а у беспозвоночных – открыва­ются. Известно также, что большая роль в появлении фоторецепторных ответов и в том, и в другом случае принадлежит ионам кальция (Dorlochter and Stieve, 1997; Говардовский, Кузьмин, 1999). Предпринятая в этой работе проверка участия ионов натрия и кальция в генерации как деполяризационных, так и гиперполяризационных ответов фоторецепторов виноградной улитки показала, что в ответ рецепторов, деполяризующихся при освещении, вносят свой вклад как ионы натрия, так и ионы кальция. Этот вывод можно сделать на том основании, что поочередное удаление этих ионов из раствора, омывающего соответству­ющие фоторецепторы, приводит к падению де-ответа до некоторого остаточного уровня. Далее, поскольку при одновременном исключении Na⁺ и Ca²⁺ деполяризационный ответ на освещение блокируется полностью, можно утверждать, что реакция фоторецепторов де-типа целиком обусловлена участием только этих ионов.

Совсем другая картина выявлена при исследовании ионной природы индуцирован­ного светом гиперполяризационного рецепторного ответа. Если раствор вокруг фоторецеп­тора гипер-типа поочередно заменяется на среду, не содержащую Na⁺ или Ca²⁺, то и в том, и в другом случае наблюдается не уменьшение (как в случае де-ответа), а увеличение ампли­туды реакции. Это увеличение говорит о более сложной ионной природе ответа фоторе­цепторов гипер-типа, который, вероятно, является суммарным итогом натрий-кальциевой деполяризации и собственно гиперполяризации, вызванной движением каких-то других ионов. Наиболее вероятным кандидатом на роль последних являются ионы калия, точ­нее фоторецепторная гиперполяризация у виноградной улитки может определяться вы­ходящим калиевым током. Хотя это необычно для позвоночных, у некоторых моллюсков фото-ответ использует калиевые каналы. Одним из таких моллюсков является гребешок, имеющий два вида топически разведенных фоторецепторов – деполяризующихся прок­симальных и гиперполяризующихся дистальных. Гиперполяризация в дистальных фото-рецепторах гребешка возникает вследствие увеличения проводимости по калию (Gomez and Nasi, 1995). По-видимому, и гиперполяризующиеся при освещении фоторецепторы виноградной улитки обладают аналогичным механизмом. Таким образом, гипер-ответ фо­торецепторов виноградной улитки при дефиците (исключении) Na⁺ и Са²⁺ связан с тем, что в норме при освещении фоторецептора ответная калиевая волна гиперполяризации частично компенсируется деполяризацией, вызванной входом ионов натрия или кальция. Это значит, что у фоторецепторов гипер-типа при действии света относительно небольшое число натриевых и кальциевых каналов все же открывается, хотя выход калия при этом доминирует.

Обобщая полученные данные, можно утверждать, что в сетчатке виноградной улитки присутствуют два типа фоторецепторов, характеризующихся разными ионными механизма­ми генерации рецепторного потенциала и, как следствие, электрической реакцией на освеще­ние противоположной полярности. В результате на следующий уровень зрительной системы от одной популяции фоторецепторов поступает деполяризация, а от другой – гиперполя­ризация. Фоторецепторные потенциалы разной полярности могут оказывать на структуры следующего уровня, способные к генерации потенциалов действия, два легко различимых эффекта: создание возбуждения одних и подавление активности других элементов. Эти эле­менты называются соответственно «яркостными» и «темновыми». Подавление спайкового разряда «темнового» (максимально активного в темноте) нервного элемента в период осве­щения это то, что может достигаться первичной фоторецепторной гиперполяризацией.